Em 22 de dezembro de 1988, exatamente uma semana após completar 44 anos, Chico Mendes foi assassinado com tiros de escopeta no peito na porta dos fundos de sua casa, quando saía de casa para tomar banho. Chico anunciou que seria morto em função de sua intensa luta pela preservação da Amazônia, e buscou proteção, mas as autoridades e a imprensa não deram atenção. Casado com Ilzamar Mendes (2ª esposa), deixou dois filhos, Sandino e Elenira, na época com dois e quatro anos de idade, respectivamente. Em 1992 foi reconhecida através de exames de DNA uma terceira filha.
Após o assassinato de Chico Mendes mais de trinta entidades sindicalistas, religiosas, políticas, de direitos humanos e ambientalistas se juntaram para formar o "Comitê Chico Mendes". Eles exigiam providencias e através de articulação nacional e internacional pressionaram os órgãos oficiais para que o crime fosse punido. Em dezembro de 1990, a justiça brasileira condenou os fazendeiros Darly Alves da Silva e Darcy Alves Ferreira, responsáveis por sua morte, a 19 anos de prisão. Darly fugiu em fevereiro de 1993 e escondeu-se num assentamento do INCRA, no interior do Pará, chegando mesmo a obter financiamento público do Banco da Amazônia sob falsa identidade. Só foi recapturado em junho de 1996. A falsidade ideológica rendeu-lhe uma segunda condenação: mais dois anos e 8 meses de prisão.
Revisão de pena
Em dezembro de 2007, uma decisão da juíza Maha Kouzi Manasfi e Manasfi concedeu ao fazendeiro Darly Alves da Silva prisão domiciliar até março de 2008. Darly havia sido recolhido ao cárcere de Rio Branco em agosto de 2006, depois de ter sido julgado e condenado em júri popular e famoso como mandante do crime.
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